Внеклеточные везикулы (ВВ) – перспективный объект биомедицинских исследований, но работа с ними требует высокой стандартизации. Чтобы результаты разных лабораторий можно было сравнивать и воспроизводить, международное сообщество разработало руководство MISEV. В этой статье мы кратко расскажем, что такое MISEV, какие рекомендации он даёт по контролю выделения ВВ, и как новый прибор NP Counter может помочь исследователям в повседневной практике.
Кратко о ВВ и методах выделения и анализа можно посмотреть здесь…
Что такое MISEV?
MISEV (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles) – это консенсусный документ, который выпускает Международное общество внеклеточных везикул (ISEV). Первая версия вышла в 2014 году, затем последовали обновления в 2018 и 2023 годах. MISEV2023 – самая актуальная редакция, обобщающая опыт более тысячи исследователей.
Главная цель MISEV – повысить воспроизводимость, строгость и прозрачность исследований ВВ. Документ не предписывает использовать конкретные методы или маркеры, а даёт рекомендации по отчётности и минимальному набору данных, которые необходимо предоставлять. MISEV охватывает номенклатуру, сбор и подготовку образцов, методы выделения, характеристику, функциональные исследования и анализ in vivo.
Ключевой принцип MISEV: выбранные методы и маркеры должны соответствовать цели исследования, а все детали эксперимента должны быть описаны настолько полно, чтобы другие могли повторить его.
Контроль выделения ВВ: на что обращает внимание MISEV2023
Выделение ВВ – лишь первый этап. Не менее важно охарактеризовать полученный препарат: определить концентрацию частиц, распределение по размеру, чистоту и функциональность. MISEV2023 подчёркивает несколько критических моментов, связанных с количественным анализом.
Концентрация частиц. Это один из основных параметров, но его измерение сопряжено с трудностями. Многие методы неспецифичны: они могут регистрировать не только ВВ, но и липопротеины, белковые агрегаты и другие наночастицы. В результате концентрация, полученная разными методами, может различаться на порядки. MISEV2023 рекомендует:
-
указывать предел обнаружения (LOD) используемого метода;
-
по возможности применять ортогональные методы (например, сочетать светорассеяние и флуоресценцию);
-
если метод не гарантирует специфичность именно к ВВ, сообщать концентрацию как «концентрацию частиц» или «внеклеточных частиц».
Распределение по размеру. MISEV2023 советует представлять не только средний или медианный диаметр, но и полное распределение, поскольку популяции ВВ часто асимметричны. Важно учитывать LOD прибора.
Чистота препарата. Необходимо проверять наличие маркеров ВВ и отсутствие основных контаминантов (липопротеинов, белков плазмы и т.д.). Для этого используют иммуноблоттинг, масс-спектрометрию и другие методы.
Воспроизводимость. Отсутствие стандартизированных протоколов приводит к тому, что данные разных лабораторий трудно сравнивать. MISEV2023 призывает документировать все этапы и параметры, чтобы результаты были надёжными.
Проблема измерения концентрации и как её решает NP Counter
Концентрация ВВ – важнейший параметр для нормализации экспериментов, оценки выхода и сравнения образцов. Однако традиционные методы (NTA, DLS, проточная цитометрия) имеют ограничения: одни не дают концентрацию, другие требуют сложной калибровки, третьи неспецифичны. В результате исследователи часто тратят много времени на рутинные измерения.
NP Counter – новый прибор для экспресс-контроля выделения внеклеточных везикул. Он недавно появился на рынке и пока мало известен, но уже сейчас используется исследователями для быстрой оценки концентрации частиц в препаратах ВВ.
Возможности NP Counter в процессе контроля выделения:
-
Быстрое измерение концентрации частиц. Прибор позволяет за короткое время получить количественные данные о концентрации в образце. Это особенно ценно при оптимизации протоколов, когда нужно сравнить несколько вариантов выделения.
-
Контроль на разных этапах. NP Counter можно использовать до и после концентрирования, после гель-фильтрации, ультрафильтрации или центрифугирования. Это помогает оценить потери везикул на каждом шаге и выбрать оптимальные условия.
-
Сравнение фракций. Прибор помогает определить, какие фракции обогащены ВВ, а какие содержат примеси. Это ускоряет подбор условий для получения чистых препаратов.
-
Оценка воспроизводимости. Регулярные измерения концентрации с помощью NP Counter позволяют отслеживать стабильность протокола и выявлять отклонения.
-
Дополнительный ортогональный метод. NP Counter может использоваться в сочетании с NTA, DLS или другими методами, что соответствует рекомендациям MISEV2023 о применении ортогональных подходов.
-
Документирование данных. Прибор даёт количественные значения, которые можно включать в публикации и supplementary материалы, повышая прозрачность исследования.
NP Counter не заменяет полноценную характеризацию, но становится удобным инструментом для рутинного контроля. Он помогает исследователям экономить время, быстрее оптимизировать протоколы и получать более надёжные результаты.
Как NP Counter вписывается в рекомендации MISEV2023
MISEV2023 призывает указывать LOD, использовать ортогональные методы и документировать концентрацию частиц. NP Counter помогает выполнить эти рекомендации на практике:
-
прибор позволяет быстро получать концентрацию частиц, которую можно сообщать в статьях;
-
его можно использовать как дополнительный метод в дополнение к другим;
-
регулярные измерения помогают подтвердить воспроизводимость выделения.
Для исследователей, которые только начинают работать с ВВ, NP Counter может стать простым способом контролировать качество препаратов без сложной подготовки. Для опытных лабораторий – удобным инструментом для рутинного мониторинга.
Прибор пока мало известен, но уже доказал свою полезность в реальных исследованиях. Если вы работаете с внеклеточными везикулами и хотите упростить контроль выделения, обратите внимание на NP Counter. Узнайте больше о приборе и его возможностях на сайте NPcounter.ru.
Публикация в Natural Science Review, в которой использовался прибор NP Counter для работы с ВВ.